Nanopore測序
納米孔測序（Nanopore sequencing）
納米孔測序（Nanopore sequencing）是一種單分子測序技術，其中DNA或RNA分子通過納米孔，產生的信號變化會被計算機處理並轉化為序列信息。在實際應用中，一種馬達蛋白（motor protein）負責控制分子的移動；多個納米孔會同時工作；而基於神經網絡的序列分析軟體（neural-network basecallers）則將原始信號轉化為可讀的序列數據。
納米孔測序的科學價值源於四個相互關聯的特性：長讀長（即能夠讀取較長的DNA序列）、實時數據採集、直接的電學檢測能力以及可攜式的儀器設備。這些特性使得納米孔測序在基因組組裝、結構變異分析、微生物監測、疫情響應、環境基因組學研究以及某些核苷酸修飾的直接檢測等方面具有廣泛的應用前景。
原則
納米孔測序過程包含三個相互關聯的步驟（或層）：
- 分子層：將DNA或RNA鏈與適配器連接在一起，然後通過酶或馬達蛋白的引導，使其穿過特定的孔洞。
- 物理層：在傳感區域內，特定的鹼基序列或短k-mer序列會調節離子電流或其他可測量的信號。
- 計算層：信號處理和鹼基調用（basecalling）將時間序列數據轉換為讀取結果（reads）、質量評分（quality scores）以及用於後續分析的文件。
通常，一個單獨的「當前水平」（current level）不會被分配給一個孤立的鹼基（base）。所測量的信號會受到局部序列環境、孔隙化學性質、馬達轉速、溫度、緩衝液成分、電子設備以及模型版本等因素的影響。因此，鹼基識別（basecalling）和修飾鹼基檢測（modified-base detection）屬於基於模型的任務，而非簡單的查找表操作。
從樣本到結果的流程
| 階段！！主要問題！！典型輸出！！質量檢查 | |||
|---|---|---|---|
| 樣品與文庫製備 | 核酸是否足夠長、純淨，並且與實驗試劑盒兼容？ | 已準備好進行測序的文庫 | 輸入參數包括：質量、片段長度、抑制劑的使用情況以及接頭連接效率 |
| 測序流程 | 是否有足夠的活躍孔隙能夠產生穩定的測序結果？ | 原始信號與測序指標 | 孔隙活性、測序片段長度分布、產量以及質量隨時間的變化 |
| Basecalling | 哪種序列分析方法最能解釋原始信號數據？ | FASTQ 或 BAM 格式的數據？ | 數據讀取的準確性、質量評分，以及與模型和化學處理方法的兼容性 |
| 對齊方式或分類 | 閱讀數據（reads）的來源是什麼？ | 被映射的閱讀數據（mapped reads）、分類單元（taxa）或連續基因片段（contigs） | 映射質量、覆蓋範圍、污染情況以及參考基因組的偏差（reference bias） |
| 解釋 | 這一結果支持了哪些生物學或技術上的結論？ | 可能的變體、組裝方式、甲基化檢測方法、相關報告 | 如有需要，還包括對照實驗、重複實驗以及正交驗證（即使用不同的方法進行驗證）。 |
優勢（Strengths）
- 「長讀長序列」（Long Reads）可以涵蓋重複序列、結構變異體、單倍型（haplotypes）、質粒（plasmids）以及複雜的基因組區域。
- 「實時排序」功能允許在運行過程中進行分析，並支持快速決策。
- 「直接檢測」技術能夠保留有關某些DNA或RNA修飾的信息。
- 可攜式儀器使得野外工作、教學活動以及在基礎設施較為匱乏的環境中進行工作成為可能。
- 「靈活的吞吐量」（Flexible throughput）既支持小規模、針對性的基因組分析項目，也適用於大規模的基因組研究項目。
限制與錯誤來源
納米孔測序不應被自動視為優於短讀長測序的方法。其適用性取決於具體的研究問題、樣本類型、所需的準確度、成本以及分析流程。納米孔測序存在一些重要的局限性，包括：
- 原始讀取錯誤以及與上下文相關的系統錯誤。
- 具有樣本級別的靈敏度，尤其適用於需要長時間閱讀的應用程式。
- 化學性質、孔隙結構以及模型版本的依賴性。
- 在某些情況下，同聚物（Homopolymer）和修飾鹼基（Modified Base）的解釋存在挑戰。
- 用於鹼基識別（basecalling）、序列比對（alignment）、基因組裝（assembly）以及變異檢測（variant calling）的計算資源要求。
- 在臨床、監管或高后果性環境中，需要實施嚴格的控制措施。
應用程式
- 基因組組裝——長讀長序列有助於解決基因組中的重複序列問題以及解決基因組的複雜結構問題。
- 結構變異（Structural variation）：長鏈DNA的變異可能包括插入、刪除、倒位、易位以及重複序列的擴展等多種形式。
- 微生物基因組學——用於快速鑑定微生物、分析其抗菌耐藥性、重組質粒以及追蹤疫情爆發。
- 宏基因組學與環境DNA——實現對混合樣本的實時分類，並嚴格控制污染風險。
- 轉錄組學與直接RNA分析——在特定工作流程中獲取異構體級別的信息及RNA修飾信號。
- 表觀遺傳學與鹼基修飾——在模型和對照組合適的情況下，檢測甲基化及其他鹼基修飾現象。
- 自適應採樣（Adaptive Sampling）——通過決定是否繼續對某個分子進行測序，實現對目標分子的實時富集或稀釋（即改變目標分子在樣本中的相對數量）。
數據和文件類型
原始的及處理過的納米孔數據可能包含 POD5 或 FAST5 信號文件、FASTQ 閱讀結果、BAM 或 CRAM 對齊文件、測序摘要文件、修飾鹼基標籤以及運行報告。良好的分析實踐會記錄所使用的儀器、流動細胞儀、化學試劑、試劑盒、鹼基識別軟體、模型版本、參考資料庫以及命令行參數等信息。
良好實踐（Good Practice）
- 在優化產量之前，需先將所使用的協議與生物學研究問題相匹配。
- 使用控制項來區分圖書館（library）、孔隙（pore）、樣品（sample）以及分析結果（analysis effects）。
- 請報告化學成分、基礎調用程序（basecaller）、模型版本以及分析參數。
- 檢查具有代表性的閱讀數據以及匯總的統計數據。
- 在可能的情況下，應通過獨立的證據來驗證那些具有重大影響的結論。
精選論文和資源
- 迪默 D、阿克森 M、布蘭頓 D。 納米孔測序的三十年. Nature Biotechnology. 2016.
- Jain M 等人。 具有超長讀長的人類基因組的納米孔測序和組裝. Nature Biotechnology. 2018.
- Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
- 王Y等人。 納米孔測序技術、生物信息學及應用. Nature Biotechnology. 2021.
- Kovaka S 等人。 Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
- Oxford Nanopore Technologies. Dorado Basecaller 及相關工具.