ナノポアシーケンシング
ナノポアシーケンシング
ナノポアシーケンシングとは、DNAやRNA分子がナノポアを通過する際に生じる信号変化を計算処理によって配列情報に変換する、単一分子シーケンシング手法です。実際のシステムでは、モータータンパク質が分子の動きを制御し、複数のナノポアが並行して動作し、ニューラルネットワークを用いた解析エンジンが原始的な信号を配列データに変換します。
ナノポアシーケンシングの科学的価値は、以下の4つの特性に由来する：長い読み取り範囲、リアルタイムでのデータ取得、直接的な電気的検出、そして携帯可能な測定装置である。これらの特性により、ゲノムアセンブリ、構造変異の解析、微生物の監視、疫病対策、環境DNAの解析、トランスクリプトミクス、および特定のヌクレオチド修飾の直接検出などに有用である。
原則
ナノポアシーケンシングの測定には3つの連携した層がある：
- 分子層 – DNAまたはRNA鎖はアダプターを用いて準備され、酵素やモータータンパク質によって孔を通して導かれる。
- 物理層 – センシング領域内の基準値や短いk-mer（k-merとは、特定の配列パターンのこと）が、イオン電流やその他の測定可能な信号を変調する。
- 計算層 – 信号処理およびベースコール処理により、時系列データが読み取りデータ、品質スコア、および後続の分析用ファイルに変換されます。
通常、単一の現在レベルは孤立したベースに割り当てられることはありません。測定された信号は、局所的な配列の文脈、孔の化学的性質、モーターの速度、温度、バッファー、電子回路、およびモデルのバージョンに依存します。このため、ベースコール（basecalling）や修正ベースの検出（modified-base detection）は、単純な参照テーブルではなく、モデルに基づいた処理となります。
サンプルから結果へのワークフロー
| ステージ！！ 主な質問！！ 通常の出力！！ 品質チェック | |||
|---|---|---|---|
| サンプルおよびライブラリの準備 | 核酸が長く、汚染がなく、キットと互換性があるか？ | シーケンシングに適したライブラリ | 入力質量、断片長、阻害剤、アダプターのリガーション効率 |
| シーケンス実行の順序 | 足りるだけの活性なポアが安定した読み取りを実現しているか？ | 生の信号データと実行メトリクス | 時間経過に伴うポアの活性、読み取り長さの分布、収量、品質 |
| Basecalling | 生の信号を最もよく説明するシーケンスは何か？ | FASTQかBAMか | 読み取りの正確性、品質スコア、モデルと化学的な互換性 |
| アライメントまたは分類 | リードデータはどこから来るのか？ | マッピングされたリードデータ、分類群、またはコンティグ | マッピングの品質、カバレッジ、汚染、参照バイアス |
| 解釈 | どのような生物学的または技術的な結論が支持されているか？ | バリアント、アセンブリ、メチル化の検出、報告書 | 必要に応じて、制御、再現性、閾値、正交検証 |
強み
- 「ロングリード（Long Reads）」とは、反復配列、構造的変異体、ハプロタイプ、プラスミド、そして複雑なゲノム領域にわたる配列データを指す。
- 「リアルタイムシーケンシング」により、実行中に分析を行うことができ、迅速な意思決定をサポートします。
- 直接検出により、DNAやRNAの特定の修飾に関する情報を保持することができる。
- ポータブル機器により、現場での作業、教育、およびインフラが整っていない環境での作業が可能になります。
- フレキシブルなスループットにより、小規模でターゲットを絞った実験や、大規模なゲノム規模のプロジェクトの両方が可能になります。
制限事項とエラーの原因
ナノポアシーケンシングを短読みシーケンシングよりも自動的に優れていると見なすべきではない。その適切性は、研究の目的、使用するサンプル、求められる精度、コスト、および解析プロセスに依存する。重要な制限事項としては以下のようなものがある：
- 生の読み取りエラーと、システム的な文脈依存型のエラー。
- サンプル品質の感度性能、特に長時間読み込みが必要なアプリケーションにおいて。
- 化学反応、細孔構造、およびモデルのバージョン依存性。
- ホモポリマーおよび改変された塩基に関する解釈上の課題（特定の文脈において）
- ベースコールイング（basecalling）、アライメント（alignment）、アセンブリ（assembly）、バリアントコールイング（variant calling）に必要な計算リソース（Computational requirements for basecalling, alignment, assembly, and variant calling）。
- 臨床現場、規制環境、または重大な結果を伴う状況においては、慎重な管理が求められる。
アプリケーション
- ゲノムアセンブリ – 長い読み取りデータ（long reads）は、反復配列の解決や構造的な複雑さの解明に役立ちます。
- 構造的変異 – 長い配列の変化には、挿入、削除、逆転、転座、および繰り返しの拡張などが含まれる。
- 微生物ゲノミクス – 迅速な同定、抗菌薬耐性の分析、プラスミドの再構築、および感染症の追跡。
- メタゲノミクスと環境DNA – 混合サンプルのリアルタイム分類、および厳格な汚染防止対策
- トランスクリプトミクスと直接RNA解析 – 選択されたワークフローにおけるアイソフォームレベルの情報およびRNA修飾のシグナル
- エピジェネティクスと塩基修飾 – モデルおよび対照群が適切な場合におけるメチル化やその他の塩基修飾の検出。
- 適応型サンプリング – 分子の配列決定を続行するかどうかを判断することにより、ターゲットをリアルタイムで増幅または減少させる手法。
データとファイルの種類
生のナノポアデータおよび処理済みのナノポアデータには、POD5やFAST5のシグナルファイル、FASTQファイル、BAMやCRAMのアライメントデータ、シーケンシングの要約ファイル、修正された塩基情報を示すタグ、および実験結果のレポートなどが含まれることがあります。適切な分析を行うためには、使用した装置、フローセルの種類、使用した化学試薬、使用したキット、塩基配列の解析ソフトウェア（ベースコーラー）、モデルのバージョン、参照データベース、およびコマンドラインで指定されたパラメータなどを記録することが重要です。
良い慣行（Good Practice）
- 収量を最適化する前に、生物学的な疑問に合わせてプロトコルを選択してください。
- ライブラリー、ポア（pore）、サンプル、および分析の効果を区別するためにコントロールを使用してください。
- 化学反応の種類、ベースコーラー（basecaller）、モデルのバージョン、および分析に使用されたパラメータを報告してください。
- 代表的な読み方の両方と集計統計の両方を検証してください。
- 可能であれば、影響の大きい結論を独立した証拠によって検証してください。
選定された論文とリソース
- ディーマー・D、アケソン・M、ブラントン・D. 「30年にわたるナノポアシーケンシング」. Nature Biotechnology. 2016.
- Jain Mら. 「ナノポアシーケンシングと超長読長を用いたヒトゲノムのアセンブリ」（Jain M et al. “Nanopore sequencing and human genome assembly using ultra-long read lengths”）. Nature Biotechnology. 2018年.
- Wick RR, Judd LM, Holt KE. オックスフォード・ナノポアシーケンシング用のニューラルネットワークベースのツールの性能. Genome Biology. 2019.
- 王Yら. 「ナノポアシーケンシング技術、バイオインフォマティクス、およびその応用」. Nature Biotechnology. 2021.
- Kovaka Sら. ターゲットを絞ったナノポアシーケンシング：未処理の電気信号をリアルタイムでマッピングすることによる手法（UNCALLED）. Nature Biotechnology. 2021.
- オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ。Dorado basecallerおよび関連ツール。