Nanopore测序
纳米孔测序（Nanopore sequencing）
纳米孔测序（Nanopore sequencing）是一种单分子测序技术，其中DNA或RNA分子通过纳米孔，产生的信号变化会被计算机处理并转化为序列信息。在实际应用中，一种马达蛋白（motor protein）负责控制分子的移动；多个纳米孔会同时工作；而基于神经网络的序列分析软件（neural-network basecallers）则将原始信号转化为可读的序列数据。
纳米孔测序的科学价值源于四个相互关联的特性：长读长（即能够读取较长的DNA序列）、实时数据采集、直接的电学检测能力以及便携式的仪器设备。这些特性使得纳米孔测序在基因组组装、结构变异分析、微生物监测、疫情响应、环境基因组学研究以及某些核苷酸修饰的直接检测等方面具有广泛的应用前景。
原则
纳米孔测序过程包含三个相互关联的步骤（或层）：
- 分子层：将DNA或RNA链与适配器连接在一起，然后通过酶或马达蛋白的引导，使其穿过特定的孔洞。
- 物理层：在传感区域内，特定的碱基序列或短k-mer序列会调节离子电流或其他可测量的信号。
- 计算层：信号处理和碱基调用（basecalling）将时间序列数据转换为读取结果（reads）、质量评分（quality scores）以及用于后续分析的文件。
通常，一个单独的“当前水平”（current level）不会被分配给一个孤立的碱基（base）。所测量的信号会受到局部序列环境、孔隙化学性质、马达转速、温度、缓冲液成分、电子设备以及模型版本等因素的影响。因此，碱基识别（basecalling）和修饰碱基检测（modified-base detection）属于基于模型的任务，而非简单的查找表操作。
从样本到结果的流程
| 阶段！！主要问题！！典型输出！！质量检查 | |||
|---|---|---|---|
| 样品与文库制备 | 核酸是否足够长、纯净，并且与实验试剂盒兼容？ | 已准备好进行测序的文库 | 输入参数包括：质量、片段长度、抑制剂的使用情况以及接头连接效率 |
| 测序流程 | 是否有足够的活跃孔隙能够产生稳定的测序结果？ | 原始信号与测序指标 | 孔隙活性、测序片段长度分布、产量以及质量随时间的变化 |
| Basecalling | 哪种序列分析方法最能解释原始信号数据？ | FASTQ 或 BAM 格式的数据？ | 数据读取的准确性、质量评分，以及与模型和化学处理方法的兼容性 |
| 对齐方式或分类 | 阅读数据（reads）的来源是什么？ | 被映射的阅读数据（mapped reads）、分类单元（taxa）或连续基因片段（contigs） | 映射质量、覆盖范围、污染情况以及参考基因组的偏差（reference bias） |
| 解释 | 这一结果支持了哪些生物学或技术上的结论？ | 可能的变体、组装方式、甲基化检测方法、相关报告 | 如有需要，还包括对照实验、重复实验以及正交验证（即使用不同的方法进行验证）。 |
优势（Strengths）
- “长读长序列”（Long Reads）可以涵盖重复序列、结构变异体、单倍型（haplotypes）、质粒（plasmids）以及复杂的基因组区域。
- “实时排序”功能允许在运行过程中进行分析，并支持快速决策。
- “直接检测”技术能够保留有关某些DNA或RNA修饰的信息。
- 便携式仪器使得野外工作、教学活动以及在基础设施较为匮乏的环境中进行工作成为可能。
- “灵活的吞吐量”（Flexible throughput）既支持小规模、针对性的基因组分析项目，也适用于大规模的基因组研究项目。
限制与错误来源
纳米孔测序不应被自动视为优于短读长测序的方法。其适用性取决于具体的研究问题、样本类型、所需的准确度、成本以及分析流程。纳米孔测序存在一些重要的局限性，包括：
- 原始读取错误以及与上下文相关的系统错误。
- 具有样本级别的灵敏度，尤其适用于需要长时间阅读的应用程序。
- 化学性质、孔隙结构以及模型版本的依赖性。
- 在某些情况下，同聚物（Homopolymer）和修饰碱基（Modified Base）的解释存在挑战。
- 用于碱基识别（basecalling）、序列比对（alignment）、基因组装（assembly）以及变异检测（variant calling）的计算资源要求。
- 在临床、监管或高后果性环境中，需要实施严格的控制措施。
应用程序
- 基因组组装——长读长序列有助于解决基因组中的重复序列问题以及解决基因组的复杂结构问题。
- 结构变异（Structural variation）：长链DNA的变异可能包括插入、删除、倒位、易位以及重复序列的扩展等多种形式。
- 微生物基因组学——用于快速鉴定微生物、分析其抗菌耐药性、重组质粒以及追踪疫情爆发。
- 宏基因组学与环境DNA——实现对混合样本的实时分类，并严格控制污染风险。
- 转录组学与直接RNA分析——在特定工作流程中获取异构体级别的信息及RNA修饰信号。
- 表观遗传学与碱基修饰——在模型和对照组合适的情况下，检测甲基化及其他碱基修饰现象。
- 自适应采样（Adaptive Sampling）——通过决定是否继续对某个分子进行测序，实现对目标分子的实时富集或稀释（即改变目标分子在样本中的相对数量）。
数据和文件类型
原始的及处理过的纳米孔数据可能包含 POD5 或 FAST5 信号文件、FASTQ 阅读结果、BAM 或 CRAM 对齐文件、测序摘要文件、修饰碱基标签以及运行报告。良好的分析实践会记录所使用的仪器、流动细胞仪、化学试剂、试剂盒、碱基识别软件、模型版本、参考数据库以及命令行参数等信息。
良好实践（Good Practice）
- 在优化产量之前，需先将所使用的协议与生物学研究问题相匹配。
- 使用控件来区分图书馆（library）、孔隙（pore）、样品（sample）以及分析结果（analysis effects）。
- 请报告化学成分、基础调用程序（basecaller）、模型版本以及分析参数。
- 检查具有代表性的阅读数据以及汇总的统计数据。
- 在可能的情况下，应通过独立的证据来验证那些具有重大影响的结论。
精选论文和资源
- 迪默 D、阿克森 M、布兰顿 D。 纳米孔测序的三十年. Nature Biotechnology. 2016.
- Jain M 等人。 具有超长读长的人类基因组的纳米孔测序和组装. Nature Biotechnology. 2018.
- Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
- 王Y等人。 纳米孔测序技术、生物信息学及应用. Nature Biotechnology. 2021.
- Kovaka S 等人。 Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
- Oxford Nanopore Technologies. Dorado Basecaller 及相关工具.