Нанопоровое секвенирование
Нанопоровое секвенирование
Нанопоровое секвенирование — это метод секвенирования отдельных молекул, при котором ДНК или РНК проходит через нанопоры и вызывает изменения сигнала, вычислительно преобразуемые в последовательность. В практических системах моторный белок управляет движением молекул, множество пор работает параллельно, а нейросетевые программы basecalling преобразуют исходный сигнал в риды.
Научная ценность нанопорового секвенирования обусловлена четырьмя взаимосвязанными свойствами: длительным чтением, сбором данных в реальном времени, прямым электрическим зондированием и портативными приборами. Эти свойства делают его полезным для сборки генома, анализа структурных вариантов, микробного надзора, реагирования на вспышки, секвенирования окружающей среды, транскриптомики и прямого обнаружения некоторых модификаций нуклеотидов.
Принцип
Измерение нанопорового секвенирования имеет три связанных слоя:
- Молекулярный слой — цепь ДНК или РНК готовится с помощью адаптеров и проводится через пору с помощью фермента или моторного белка.
- Физический уровень - основания или короткие k-мерные контексты внутри чувствительной области модулируют ионный ток или другой измеримый сигнал.
- Вычислительный уровень — обработка сигналов и basecalling преобразуют временные ряды в риды, оценки качества и файлы для последующего анализа.
Один уровень тока обычно не соответствует одному изолированному основанию. Измеряемый сигнал зависит от локального контекста последовательности, химии поры, скорости моторного белка, температуры, буфера, электроники и версии модели. Поэтому определение последовательности и обнаружение модифицированных оснований требуют моделей, а не простых таблиц соответствия.
Рабочий процесс от образца до результата
| Этап | Главный вопрос | Типичный результат | Проверка качества |
|---|---|---|---|
| Подготовка образцов и библиотек | Является ли нуклеиновая кислота длинной, чистой и совместимой с набором? | Библиотека, готовая к секвенированию | Вводимая масса, длина фрагмента, ингибиторы, эффективность лигирования адаптера |
| Прогон секвенирования | Достаточно ли активных пор, обеспечивающих стабильное чтение? | Необработанный сигнал и метрики выполнения | Активность пор, распределение длины считывания, выход, качество с течением времени |
| Basecalling | Какая последовательность лучше всего объясняет исходный сигнал? | Риды FASTQ или BAM | Точность ридов, оценки качества и совместимость модели с химией |
| Согласование или классификация | Откуда берутся чтения? | Сопоставленные чтения, таксоны или контиги | Качество картирования, охват, загрязнение, смещение ссылок |
| Интерпретация | Какой биологический или технический вывод подтверждается? | Варианты, сборки, вызовы метилирования, отчеты | Контроль, репликация, пороговые значения, ортогональная проверка при необходимости |
Сильные стороны
- Длинное чтение может охватывать повторы, структурные варианты, гаплотипы, плазмиды и сложные геномные области.
- Секвенирование в реальном времени позволяет проводить анализ во время работы и поддерживает быстрое принятие решений.
- Прямое зондирование может сохранять информацию о некоторых модификациях ДНК или РНК.
- Портативные инструменты делает возможными рабочие процессы в полевых условиях, обучении и с низким уровнем инфраструктуры.
- Гибкая пропускная способность позволяет проводить небольшие целевые прогоны и более крупные проекты в масштабе генома.
Ограничения и источники ошибок
Нанопоровое секвенирование не следует рассматривать как автоматически превосходящее секвенирование с коротким считыванием. Его пригодность зависит от вопроса, образца, требуемой точности, стоимости и конвейера анализа. Важные ограничения включают в себя:
- Необработанные ошибки чтения и систематические контекстно-зависимые ошибки.
- Чувствительность качества выборки, особенно для приложений с длительным считыванием.
- Зависимость от химического состава, пор и версии модели.
- Проблемы интерпретации гомополимеров и модифицированных оснований в некоторых контекстах.
- Вычислительные требования для basecalling, выравнивания, сборки и определения вариантов.
- Необходимость тщательного контроля в клинических, нормативных условиях или в условиях с высокими последствиями.
Приложения
- Сборка генома — длинные чтения помогают устранить повторы и структурную сложность.
- Структурные вариации — длинные чтения могут охватывать вставки, делеции, инверсии, транслокации и повторные расширения.
- Микробная геномика - быстрая идентификация, анализ устойчивости к противомикробным препаратам, реконструкция плазмиды и отслеживание вспышек.
- Метагеномика и ДНК окружающей среды — классификация смешанных проб в реальном времени с тщательным контролем загрязнения.
- Транскриптомика и прямая РНК — информация на уровне изоформ и сигналы модификации РНК в выбранных рабочих процессах.
- Эпигенетика и базовые модификации - обнаружение метилирования и других модификаций, когда модели и контроли являются подходящими.
- Адаптивная выборка — обогащение или истощение мишеней в реальном времени путем принятия решения о продолжении секвенирования молекулы.
Типы данных и файлов
Исходные и обработанные нанопоровые данные могут включать сигналы POD5 или FAST5, риды FASTQ, выравнивания BAM или CRAM, сводки секвенирования, теги модифицированных оснований и отчеты о запуске. Для воспроизводимого анализа фиксируют прибор, проточную ячейку, химию, набор реагентов, программу basecalling, версию модели, референсную базу данных и параметры командной строки.
Передовая практика
- Прежде чем оптимизировать выход, сопоставьте протокол с биологическим вопросом.
- Используйте элементы управления для разделения эффектов библиотеки, пор, образца и анализа.
- Укажите химию, программу basecalling, версию модели и параметры анализа.
- Проверьте как репрезентативные чтения, так и совокупную статистику.
- По возможности подтвердите важные выводы независимыми доказательствами.
Избранные статьи и ресурсы
- Димер Д., Акесон М., Брэнтон Д. Три десятилетия нанопорового секвенирования. Nature Biotechnology. 2016.
- Jain M et al. Нанопоровое секвенирование и сборка генома человека с помощью сверхдлинных чтений. Nature Biotechnology. 2018.
- Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
- Wang Y et al. Технология нанопорового секвенирования, биоинформатика и приложения. Nature Biotechnology. 2021.
- Ковака С. et al. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
- Oxford Nanopore Technologies. Программа basecalling Dorado и связанные инструменты.