Нанопоровое секвенирование

Нанопоровое секвенирование — это метод секвенирования отдельных молекул, при котором ДНК или РНК проходит через нанопоры и вызывает изменения сигнала, вычислительно преобразуемые в последовательность. В практических системах моторный белок управляет движением молекул, множество пор работает параллельно, а нейросетевые программы basecalling преобразуют исходный сигнал в риды.

Научная ценность нанопорового секвенирования обусловлена четырьмя взаимосвязанными свойствами: длительным чтением, сбором данных в реальном времени, прямым электрическим зондированием и портативными приборами. Эти свойства делают его полезным для сборки генома, анализа структурных вариантов, микробного надзора, реагирования на вспышки, секвенирования окружающей среды, транскриптомики и прямого обнаружения некоторых модификаций нуклеотидов.

Принцип

Измерение нанопорового секвенирования имеет три связанных слоя:

Молекулярный слой — цепь ДНК или РНК готовится с помощью адаптеров и проводится через пору с помощью фермента или моторного белка.
Физический уровень - основания или короткие k-мерные контексты внутри чувствительной области модулируют ионный ток или другой измеримый сигнал.
Вычислительный уровень — обработка сигналов и basecalling преобразуют временные ряды в риды, оценки качества и файлы для последующего анализа.

Один уровень тока обычно не соответствует одному изолированному основанию. Измеряемый сигнал зависит от локального контекста последовательности, химии поры, скорости моторного белка, температуры, буфера, электроники и версии модели. Поэтому определение последовательности и обнаружение модифицированных оснований требуют моделей, а не простых таблиц соответствия.

Рабочий процесс от образца до результата

Этап	Главный вопрос	Типичный результат	Проверка качества
Подготовка образцов и библиотек	Является ли нуклеиновая кислота длинной, чистой и совместимой с набором?	Библиотека, готовая к секвенированию	Вводимая масса, длина фрагмента, ингибиторы, эффективность лигирования адаптера
Прогон секвенирования	Достаточно ли активных пор, обеспечивающих стабильное чтение?	Необработанный сигнал и метрики выполнения	Активность пор, распределение длины считывания, выход, качество с течением времени
Basecalling	Какая последовательность лучше всего объясняет исходный сигнал?	Риды FASTQ или BAM	Точность ридов, оценки качества и совместимость модели с химией
Согласование или классификация	Откуда берутся чтения?	Сопоставленные чтения, таксоны или контиги	Качество картирования, охват, загрязнение, смещение ссылок
Интерпретация	Какой биологический или технический вывод подтверждается?	Варианты, сборки, вызовы метилирования, отчеты	Контроль, репликация, пороговые значения, ортогональная проверка при необходимости

Сильные стороны

Длинное чтение может охватывать повторы, структурные варианты, гаплотипы, плазмиды и сложные геномные области.
Секвенирование в реальном времени позволяет проводить анализ во время работы и поддерживает быстрое принятие решений.
Прямое зондирование может сохранять информацию о некоторых модификациях ДНК или РНК.
Портативные инструменты делает возможными рабочие процессы в полевых условиях, обучении и с низким уровнем инфраструктуры.
Гибкая пропускная способность позволяет проводить небольшие целевые прогоны и более крупные проекты в масштабе генома.

Ограничения и источники ошибок

Нанопоровое секвенирование не следует рассматривать как автоматически превосходящее секвенирование с коротким считыванием. Его пригодность зависит от вопроса, образца, требуемой точности, стоимости и конвейера анализа. Важные ограничения включают в себя:

Необработанные ошибки чтения и систематические контекстно-зависимые ошибки.
Чувствительность качества выборки, особенно для приложений с длительным считыванием.
Зависимость от химического состава, пор и версии модели.
Проблемы интерпретации гомополимеров и модифицированных оснований в некоторых контекстах.
Вычислительные требования для basecalling, выравнивания, сборки и определения вариантов.
Необходимость тщательного контроля в клинических, нормативных условиях или в условиях с высокими последствиями.

Приложения

Сборка генома — длинные чтения помогают устранить повторы и структурную сложность.
Структурные вариации — длинные чтения могут охватывать вставки, делеции, инверсии, транслокации и повторные расширения.
Микробная геномика - быстрая идентификация, анализ устойчивости к противомикробным препаратам, реконструкция плазмиды и отслеживание вспышек.
Метагеномика и ДНК окружающей среды — классификация смешанных проб в реальном времени с тщательным контролем загрязнения.
Транскриптомика и прямая РНК — информация на уровне изоформ и сигналы модификации РНК в выбранных рабочих процессах.
Эпигенетика и базовые модификации - обнаружение метилирования и других модификаций, когда модели и контроли являются подходящими.
Адаптивная выборка — обогащение или истощение мишеней в реальном времени путем принятия решения о продолжении секвенирования молекулы.

Типы данных и файлов

Исходные и обработанные нанопоровые данные могут включать сигналы POD5 или FAST5, риды FASTQ, выравнивания BAM или CRAM, сводки секвенирования, теги модифицированных оснований и отчеты о запуске. Для воспроизводимого анализа фиксируют прибор, проточную ячейку, химию, набор реагентов, программу basecalling, версию модели, референсную базу данных и параметры командной строки.

Передовая практика

Прежде чем оптимизировать выход, сопоставьте протокол с биологическим вопросом.
Используйте элементы управления для разделения эффектов библиотеки, пор, образца и анализа.
Укажите химию, программу basecalling, версию модели и параметры анализа.
Проверьте как репрезентативные чтения, так и совокупную статистику.
По возможности подтвердите важные выводы независимыми доказательствами.

Избранные статьи и ресурсы

Димер Д., Акесон М., Брэнтон Д. Три десятилетия нанопорового секвенирования. Nature Biotechnology. 2016.
Jain M et al. Нанопоровое секвенирование и сборка генома человека с помощью сверхдлинных чтений. Nature Biotechnology. 2018.
Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
Wang Y et al. Технология нанопорового секвенирования, биоинформатика и приложения. Nature Biotechnology. 2021.
Ковака С. et al. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
Oxford Nanopore Technologies. Программа basecalling Dorado и связанные инструменты.