التسلسل بالمسام النانوية

التسلسل بالمسام النانوية هو أسلوب لتسلسل الجزيئات المفردة تمر فيه جزيئات DNA أو RNA عبر المسام النانوية وتنتج تغيرات في الإشارة تحوّل حسابيا إلى معلومات تسلسلية. في الأنظمة العملية يتحكم بروتين حركي في حركة الجزيئات، وتعمل مسام عديدة بالتوازي، وتحول برامج استنتاج تسلسل القواعد بالشبكات العصبية الإشارة الخام إلى قراءات.

تأتي القيمة العلمية لتسلسل المسام النانوية من أربع خصائص متصلة: القراءات الطويلة، والاكتساب في الوقت الحقيقي، والاستشعار الكهربائي المباشر، والأجهزة المحمولة. هذه الخصائص تجعلها مفيدة لتجميع الجينوم، وتحليل المتغيرات الهيكلية، والمراقبة الميكروبية، والاستجابة لتفشي المرض، والتسلسل البيئي، والنسخ، والكشف المباشر عن بعض تعديلات النوكليوتيدات.

المبدأ

يحتوي قياس تسلسل المسام النانوية على ثلاث طبقات مقترنة:

الطبقة الجزيئية - يتم تحضير شريط DNA أو RNA باستخدام محولات ويتم توجيهه عبر المسام بواسطة إنزيم أو بروتين محرك.
الطبقة المادية - تقوم القواعد أو سياقات k-mer القصيرة داخل منطقة الاستشعار بتعديل التيار الأيوني أو إشارة أخرى قابلة للقياس.
الطبقة الحسابية - تحوّل معالجة الإشارات واستنتاج تسلسل القواعد بيانات السلاسل الزمنية إلى قراءات ودرجات جودة وملفات للتحليل اللاحق.

لا ينسب مستوى تيار واحد عادة إلى قاعدة معزولة واحدة. تعتمد الإشارة المقاسة على سياق التسلسل المحلي وكيمياء المسام وسرعة البروتين الحركي ودرجة الحرارة والمحلول المنظم والإلكترونيات وإصدار النموذج. لذلك يعتمد استنتاج تسلسل القواعد وكشف القواعد المعدلة على نماذج، وليس على جداول مطابقة بسيطة.

سير العمل من العينة إلى النتيجة

المرحلة	السؤال الرئيسي	إخراج نموذجي	فحوصات الجودة
تحضير العينة والمكتبة	هل الحمض النووي طويل ونظيف ومتوافق مع المجموعة؟	مكتبة جاهزة للتسلسل	كتلة الإدخال، طول القطعة، المثبطات، كفاءة ربط المحول
تشغيل التسلسل	هل المسام النشطة كافية لإنتاج قراءات مستقرة؟	الإشارة الأولية ومقاييس التشغيل	نشاط المسام، قراءة توزيع الطول، العائد، الجودة مع مرور الوقت
استنتاج تسلسل القواعد	ما التسلسل الذي يفسر الإشارة الخام بأفضل صورة؟	قراءات FASTQ أو BAM	دقة القراءات ودرجات الجودة وتوافق النموذج مع الكيمياء
المحاذاة أو التصنيف	أين تنشأ القراءات؟	القراءات المعينة أو الأصناف أو contigs	جودة رسم الخرائط، والتغطية، والتلوث، والتحيز المرجعي
التفسير	ما هو الاستنتاج البيولوجي أو التقني المدعوم؟	المتغيرات، التجميعات، استدعاءات المثيلة، التقارير	الضوابط، والنسخ المتماثل، والعتبات، والتحقق المتعامد عند الحاجة

نقاط القوة

القراءات الطويلة يمكن أن تغطي التكرارات والمتغيرات البنيوية والأنماط الفردانية والبلازميدات والمناطق الجينومية المعقدة.
التسلسل في الوقت الحقيقي يسمح بالتحليل أثناء التشغيل ويدعم اتخاذ القرار السريع.
الاستشعار المباشر يمكن أن يحافظ على معلومات عن بعض تعديلات DNA أو RNA.
الأدوات المحمولة يجعل سير العمل الميداني والتدريسي والبنية التحتية المنخفضة أمرًا ممكنًا.
إنتاجية مرنة يسمح بعمليات تشغيل مستهدفة صغيرة ومشاريع أكبر على نطاق الجينوم.

القيود ومصادر الخطأ

لا ينبغي التعامل مع تسلسل Nanopore على أنه متفوق تلقائيًا على تسلسل القراءة القصيرة. وتعتمد ملاءمتها على السؤال والعينة والدقة المطلوبة والتكلفة وخط أنابيب التحليل. تشمل القيود المهمة ما يلي:

أخطاء القراءة الأولية والأخطاء المنهجية المعتمدة على السياق.
حساسية جودة العينة، خاصة للتطبيقات طويلة القراءة.
الاعتماد على الكيمياء والمسام وإصدار النموذج.
تحديات تفسير البوليمر المتجانس والقاعدة المعدلة في بعض السياقات.
المتطلبات الحسابية لاستنتاج تسلسل القواعد والمحاذاة والتجميع وتحديد المتغيرات.
الحاجة إلى ضوابط دقيقة في الإعدادات السريرية أو التنظيمية أو ذات العواقب العالية.

التطبيقات

تجميع الجينوم - تساعد القراءات الطويلة في حل التكرارات والتعقيد الهيكلي.
الاختلاف الهيكلي - يمكن للقراءات الطويلة أن تمتد إلى عمليات الإدراج والحذف والعكس والنقل والتوسعات المتكررة.
علم الجينوم الميكروبي - التحديد السريع، وتحليل مقاومة مضادات الميكروبات، وإعادة بناء البلازميد، وتتبع تفشي المرض.
الميتاجينوميات والحمض النووي البيئي - تصنيف فوري للعينات المختلطة، مع التحكم الدقيق في التلوث.
علم النسخ والحمض النووي الريبي المباشر - معلومات على مستوى الشكل الإسوي وإشارات تعديل الحمض النووي الريبي (RNA) في سير العمل المحدد.
علم الوراثة والتعديلات الأساسية - الكشف عن المثيلة والتعديلات الأخرى عندما تكون النماذج والضوابط مناسبة.
أخذ العينات التكيفية - إثراء الأهداف أو استنفادها في الوقت الفعلي من خلال تحديد ما إذا كان سيتم الاستمرار في تسلسل الجزيء أم لا.

أنواع البيانات والملفات

قد تشمل بيانات المسام النانوية الخام والمعالجة ملفات إشارات POD5 أو FAST5 وقراءات FASTQ ومحاذاة BAM أو CRAM وملخصات التسلسل ووسوم القواعد المعدلة وتقارير التشغيل. توثق ممارسات التحليل الجيدة الجهاز وخلية التدفق والكيمياء ومجموعة الكواشف وبرنامج استنتاج تسلسل القواعد وإصدار النموذج وقاعدة البيانات المرجعية ومعلمات سطر الأوامر.

الممارسة الجيدة

قم بمطابقة البروتوكول مع السؤال البيولوجي قبل تحسين الإنتاجية.
استخدم عناصر التحكم لفصل تأثيرات المكتبة والمسام والعينة والتحليل.
وثق الكيمياء وبرنامج استنتاج تسلسل القواعد وإصدار النموذج ومعلمات التحليل.
فحص كل من القراءات التمثيلية والإحصائيات المجمعة.
التحقق من صحة الاستنتاجات عالية التأثير باستخدام أدلة مستقلة عندما يكون ذلك ممكنًا.

أوراق وموارد مختارة

ديمر د، أكيسون إم، برانتون د. ثلاثة عقود من تسلسل المسام النانوية. Nature Biotechnology. 2016.
جاين م وآخرون. تسلسل المسام النانوية وتجميع الجينوم البشري مع قراءات طويلة جدًا. Nature Biotechnology. 2018.
Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
وانغ واي وآخرون. تكنولوجيا تسلسل المسام النانوية والمعلوماتية الحيوية والتطبيقات. Nature Biotechnology. 2021.
كوفاكا إس وآخرون. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
Oxford Nanopore Technologies. برنامج Dorado لاستنتاج تسلسل القواعد والأدوات المرتبطة به.