Nanopore测序
纳米孔测序（Nanopore sequencing）
纳米孔测序（Nanopore sequencing）是一种单分子测序技术，其中DNA或RNA分子通过纳米孔，产生的信号变化会被计算机处理并转化为序列信息。在实际应用中，一种马达蛋白（motor protein）负责控制分子的移动；多个纳米孔会同时工作；而基于神经网络的序列分析软件（neural-network basecallers）则将原始信号转化为可读的序列数据。
纳米孔测序的科学价值源于四个相互关联的特性：长读长（即能够读取较长的DNA序列）、实时数据采集、直接的电学检测能力以及便携式的仪器设备。这些特性使得纳米孔测序在基因组组装、结构变异分析、微生物监测、疫情响应、环境基因组学研究以及某些核苷酸修饰的直接检测等方面具有广泛的应用前景。
原则
纳米孔测序过程包含三个相互关联的步骤（或层）：
- 分子层：将DNA或RNA链与适配器连接在一起，然后通过酶或马达蛋白的引导，使其穿过特定的孔洞。
- 物理层：在传感区域内，特定的碱基序列或短k-mer序列会调节离子电流或其他可测量的信号。
- 计算层：信号处理和碱基调用（basecalling）将时间序列数据转换为读取结果（reads）、质量评分（quality scores）以及用于后续分析的文件。
通常，一个单独的“当前水平”（current level）不会被分配给一个孤立的碱基（base）。所测量的信号会受到局部序列环境、孔隙化学性质、马达转速、温度、缓冲液成分、电子设备以及模型版本等因素的影响。因此，碱基识别（basecalling）和修饰碱基检测（modified-base detection）属于基于模型的任务，而非简单的查找表操作。
从样本到结果的流程
| 阶段！！主要问题！！典型输出！！质量检查 | |||
|---|---|---|---|
| 样品与文库制备 | 核酸是否足够长、纯净，并且与实验试剂盒兼容？ | 已准备好进行测序的文库 | 输入参数包括：质量、片段长度、抑制剂的使用情况以及接头连接效率 |
| 测序流程 | 是否有足够的活跃孔隙能够产生稳定的测序结果？ | 原始信号与测序指标 | 孔隙活性、测序片段长度分布、产量以及质量随时间的变化 |
| Basecalling | 哪种序列分析方法最能解释原始信号数据？ | FASTQ 或 BAM 格式的数据？ | 数据读取的准确性、质量评分，以及与模型和化学处理方法的兼容性 |
| 对齐方式或分类 | 阅读数据（reads）的来源是什么？ | 被映射的阅读数据（mapped reads）、分类单元（taxa）或连续基因片段（contigs） | 映射质量、覆盖范围、污染情况以及参考基因组的偏差（reference bias） |
| 解释 | 这一结果支持了哪些生物学或技术上的结论？ | 可能的变体、组装方式、甲基化检测方法、相关报告 | 如有需要，还包括对照实验、重复实验以及正交验证（即使用不同的方法进行验证）。 |
- 样本制备和文库构建。
- 在纳米孔设备上进行测序。
- 从原始信号到核苷酸序列的碱基识别。
- 质量控制和过滤。
- 对齐、组装、变异调用或宏基因组分类。
- 解释和报告。
相关页面
Data and file types
Raw and processed nanopore data may include POD5 or FAST5 signal files, FASTQ reads, BAM or CRAM alignments, sequencing-summary files, modified-base tags, and run reports. Good analysis practice records the instrument, flow cell, chemistry, kit, basecaller, model version, reference database, and command-line parameters.
Good practice
- Match the protocol to the biological question before optimizing yield.
- Use controls to separate library, pore, sample, and analysis effects.
- Report chemistry, basecaller, model version, and analysis parameters.
- Inspect both representative reads and aggregate statistics.
- Validate high-impact conclusions with independent evidence when possible.
Selected papers and resources
- Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 2016.
- Jain M et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 2018.
- Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
- Wang Y et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology. 2021.
- Kovaka S et al. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
- Oxford Nanopore Technologies. Dorado basecaller and related tools.