Secuenciación por nanoporos

La secuenciación por nanoporos es un método de secuenciación de moléculas individuales en el que las moléculas de ADN o ARN pasan a través de nanoporos, lo que genera cambios en las señales que posteriormente se convierten en información de secuencia mediante procesos computacionales. En los sistemas prácticos, una proteína motora controla el movimiento molecular; muchos nanoporos funcionan en paralelo, y los algoritmos basados en redes neuronales traducen las señales brutales en datos de secuencia.

El valor científico del secuenciamiento de nanoporos proviene de cuatro propiedades clave: lecturas de larga duración, adquisición de datos en tiempo real, detección eléctrica directa e instrumentación portátil. Estas características lo hacen útil para el ensamblaje de genomas, el análisis de variantes estructurales, la vigilancia microbiana, la respuesta a brotes epidémicos, el secuenciamiento ambiental, la transcriptómica y la detección directa de algunas modificaciones en los nucleótidos.

Principio

Una medición de secuenciación por nanoporos consta de tres capas acopladas:

Capa molecular: Una hebra de ADN o ARN se prepara con adaptadores y es guiada a través de un poro por una enzima o una proteína motora.
Capa física: Los contextos de bases o k-meres cortos dentro de la región de detección modulan la corriente iónica u otro señal medible.
Capa computacional: El procesamiento de señales y la base de datos convierten los datos de series temporales en lecturas, puntuaciones de calidad y archivos para el análisis posterior.

Por lo general, no se asigna un único nivel actual a una base aislada. La señal medida depende del contexto de la secuencia local, de la química de los poros, de la velocidad del motor, de la temperatura, del buffer, de la electrónica y de la versión del modelo. Por esta razón, el proceso de identificación de bases (basecalling) y la detección de bases modificadas (modified-base detection) son tareas basadas en modelos, y no simplemente tablas de consulta.

Flujo de trabajo desde el ejemplo hasta el resultado

Etapa:	Pregunta principal	Resultado típico:	Verificaciones de calidad
Preparación de muestras y bibliotecas	¿Es el ácido nucleico largo, limpio y compatible con el kit?	Biblioteca lista para secuenciación	Masa de entrada, longitud de los fragmentos, inhibidores, eficiencia de ligación de los adaptadores
Secuenciación de ejecuciones	¿Son suficientes los poros activos para producir lecturas estables?	Señal bruta y métricas de ejecución	Actividad de los poros, distribución de la longitud de las lecturas, rendimiento y calidad a lo largo del tiempo
Lecturas FASTQ o BAM \| Precisión de lectura, puntuaciones de calidad, compatibilidad con modelos y química
Alineación o clasificación	¿De dónde provienen los datos de lectura?	Datos de lectura mapeados, taxones o contigs	Calidad del mapeo, cobertura, contaminación, sesgo de referencia
Interpretación	¿Qué conclusión biológica o técnica se respalda?	Variantes, ensamblajes, análisis de metilación, informes	Controles, replicación, umbrales, validación ortogonal cuando sea necesario

Fortalezas

Los textos extensos pueden abarcar repeticiones, variantes estructurales, haplotipos, plásmidos y regiones genómicas complejas.
La secuenciación en tiempo real permite el análisis durante el proceso y respalda la toma de decisiones rápidas.
La sensación directa puede conservar información sobre algunas modificaciones en el ADN o ARN.
Los instrumentos portátiles hacen posibles los trabajos en el campo, la enseñanza y los procesos que requieren poca infraestructura.
La capacidad de procesamiento flexible (flexible throughput) permite realizar operaciones de análisis de datos de pequeña escala y proyectos a gran escala que involucran genomas completos.

Limitaciones y fuentes de errores

El secuenciamiento mediante nanoporos no debería considerarse automáticamente superior al secuenciamiento de lecturas cortas. Su idoneidad depende del problema de investigación, de la muestra analizada, de la precisión requerida, del costo y del proceso de análisis utilizado. Algunas limitaciones importantes incluyen:

Errores de lectura sin procesar y errores sistemáticos que dependen del contexto.
Una sensibilidad de calidad de muestreo, especialmente para aplicaciones de lectura extensa.
Química, poros y dependencia de la versión del modelo.
Desafíos en la interpretación de homopolímeros y bases modificadas en algunos contextos.
Requisitos computacionales para la secuenciación de bases, la alineación de secuencias, el ensamblaje de proteínas y la identificación de variantes genéticas.
Es necesaria una supervisión cuidadosa en entornos clínicos, regulatorios o de gran importancia.

Aplicaciones

Asamblea de genomas: Las lecturas largas ayudan a resolver las repeticiones y la complejidad estructural.
Variedad estructural: Las lecturas extensas pueden incluir inserciones, eliminaciones, inversiones, translocaciones y expansiones repetidas.
Genómica microbiana: identificación rápida, análisis de la resistencia a los antimicrobianos, reconstrucción de plásmidos y seguimiento de brotes.
Metagenómica y ADN ambiental: clasificación en tiempo real de muestras mixtas, con un cuidadoso control de la contaminación.
Transcriptómica y ARN directo: información a nivel de isoformas y señales de modificación del ARN en flujos de trabajo seleccionados.
Epigenética y modificaciones en las bases genéticas: detección de la metilación y otras modificaciones cuando los modelos y los grupos de control sean adecuados.
Muestreo adaptativo: enriquecimiento o disminución en tiempo real de los objetivos de análisis, mediante la decisión de continuar secuenciando una molécula o no.

Datos y tipos de archivos

Los datos brutos y procesados de nanoporos pueden incluir archivos de señales en formato POD5 o FAST5, lecturas en formato FASTQ, alineamientos de secuencias en formato BAM o CRAM, archivos de resumen de secuenciación, etiquetas de bases modificadas y informes de ejecución. Una buena práctica de análisis registra el instrumento utilizado, la celda de flujo, los reactivos químicos empleados, el kit utilizado para el análisis, el software utilizado para la identificación de bases (basecaller), la versión del modelo, la base de datos de referencia y los parámetros de la línea de comandos.

Buena práctica

Ajuste el protocolo en función de la pregunta biológica antes de optimizar el rendimiento.
Use controles para separar los efectos de la biblioteca, el poro, la muestra y el análisis.
Reporte los datos de química, el método utilizado para la identificación de compuestos (basecaller), la versión del modelo y los parámetros de análisis.
Examine tanto las lecturas representativas como las estadísticas agregadas.
Valida las conclusiones de alto impacto con evidencia independiente siempre que sea posible.

Artículos y recursos seleccionados

Deamer D, Akeson M, Branton D. Tres décadas de secuenciación de nanoporos. Nature Biotechnology. 2016.
Jain M et al. Secuenciación por nanoporos y ensamblaje de un genoma humano mediante lecturas ultralargas. Nature Biotechnology. 2018.
Wick RR, Judd LM, Holt KE. Rendimiento de las herramientas de basecalling basadas en redes neuronales para el secuenciamiento de Oxford Nanopore. Genome Biology. 2019.
Wang Y et al. Tecnología de secuenciación por nanoporos, bioinformática y aplicaciones. Nature Biotechnology. 2021.
Kovaka S et al. Secuenciación de nanoporos dirigida mediante el mapeo en tiempo real de la señal eléctrica bruta con UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
Oxford Nanopore Technologies. Dorado basecaller y herramientas relacionadas.