Séquençage par nanopores

La séquençage par nanopores est une méthode de séquençage à l'échelle de la molécule unique, dans laquelle des molécules d'ADN ou d'ARN passent à travers des nanopores, provoquant des changements de signal qui sont ensuite convertis en informations de séquence par des algorithmes informatiques. Dans les systèmes pratiques, une protéine motrice contrôle le mouvement des molécules ; de nombreux nanopores fonctionnent en parallèle, et des logiciels basés sur des réseaux de neurones interprètent ces signaux bruts pour produire des séquences d'ADN ou d'ARN.

La valeur scientifique du séquençage par nanopores provient de quatre propriétés essentielles : des lectures de longueur importante des séquences, une acquisition en temps réel, une détection électrique directe des modifications des séquences, et un équipement portable. Ces caractéristiques en font un outil très utile pour l’assemblage des génomes, l’analyse des variantes structurelles, la surveillance des micro-organismes, la réponse aux épidémies, le séquençage de l’environnement, la transcriptomique, ainsi que la détection directe de certaines modifications des nucléotides.

Principe

Une mesure de séquençage par nanopore comporte trois couches liées entre elles :

Couche moléculaire : Une chaîne d'ADN ou d'ARN est préparée avec des adaptateurs et guidée à travers une pore par une enzyme ou une protéine motrice.
Couche physique : Les bases ou les contextes de k-mer courts, situés à l’intérieur de la zone de détection, modulent le courant ionique ou un autre signal mesurable.
Couche computationnelle – Le traitement du signal et l’analyse des données convertissent les séries temporelles en résultats de lecture, en scores de qualité, ainsi que en fichiers destinés à des analyses ultérieures.

Un seul niveau actuel n’est généralement pas attribué à une base isolée. Le signal mesuré dépend du contexte de séquence local, de la chimie des pores, de la vitesse du moteur, de la température, du tampon utilisé, de l’électronique, ainsi que de la version du modèle. C’est pourquoi l’identification des bases (basecalling) et la détection des bases modifiées sont des tâches basées sur des modèles, et non des simples tableaux de référence.

Chemin de travail allant de l'échantillon au résultat

Étape	Question principale	Sortie typique	Contrôles de qualité
Préparation des échantillons et des bibliothèques	L’acide nucléique est-il suffisamment long, pur et compatible avec le kit ?	Bibliothèque prête à la séquençage	Masse d’entrée, longueur des fragments, inhibiteurs, efficacité de la liaison des adaptateurs
Ordre des exécutions	Les pores actifs sont-ils suffisants pour produire des lectures stables ?	Signal brut et métriques des exécutions	Activité des pores, distribution de la longueur des lectures, rendement, qualité au fil du temps
Basecalling	Quelle séquence explique le mieux le signal brut ?	Lectures FASTQ ou BAM	Précision des lectures, scores de qualité, compatibilité avec les modèles et les procédés chimiques
Alignement ou classification	D'où proviennent les données de lecture ?	Données de lecture mappées, taxons ou contigs	Qualité de la cartographie, couverture, contamination, biais de référence
Interprétation	Quelle conclusion biologique ou technique est soutenue ?	Variants, assemblages, analyses de méthylation, rapports	Contrôles, réplication, seuils, validation orthogonale si nécessaire

Atouts

Les « longs textes » peuvent couvrir des répétitions, des variantes structurelles, des haplotypes, des plasmides, ainsi que des régions génomiques complexes.
La séquençage en temps réel permet une analyse pendant l'exécution des procédures et facilite la prise de décisions rapides.
La « détection directe » peut conserver des informations sur certaines modifications de l'ADN ou de l'ARN.
Les instruments portables rendent possibles les travaux sur le terrain, l'enseignement ainsi que les activités dans des environnements à faible infrastructure.
La « capacité de traitement flexible » (flexible throughput) permet de mener des analyses de petite envergure ciblées, ainsi que des projets à l’échelle du génome.

Limitations et sources d'erreurs

Le séquençage par nanopores ne devrait pas être considéré comme automatiquement supérieur au séquençage à lecture courte. Sa pertinence dépend de la question étudiée, de l'échantillon utilisé, de la précision requise, des coûts et du pipeline d'analyse. Parmi les limites importantes, on peut citer :

Erreurs de lecture brutes et erreurs systématiques dépendantes du contexte.
Une sensibilité de qualité, particulièrement adaptée aux applications nécessitant de longs temps de lecture.
Dépendance de la chimie, des pores et de la version du modèle.
Défis liés à l'interprétation des homopolymères et des bases modifiées dans certains contextes.
Exigences en matière de ressources informatiques pour le séquençage, l'alignement des séquences, l'assemblage des acides aminés et l'identification des variants génétiques.
Besoin de contrôles rigoureux dans des environnements cliniques, réglementaires ou à fort enjeu.

Data and file types

Raw and processed nanopore data may include POD5 or FAST5 signal files, FASTQ reads, BAM or CRAM alignments, sequencing-summary files, modified-base tags, and run reports. Good analysis practice records the instrument, flow cell, chemistry, kit, basecaller, model version, reference database, and command-line parameters.

Good practice

Match the protocol to the biological question before optimizing yield.
Use controls to separate library, pore, sample, and analysis effects.
Report chemistry, basecaller, model version, and analysis parameters.
Inspect both representative reads and aggregate statistics.
Validate high-impact conclusions with independent evidence when possible.

Selected papers and resources

Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 2016.
Jain M et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 2018.
Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
Wang Y et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology. 2021.
Kovaka S et al. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
Oxford Nanopore Technologies. Dorado basecaller and related tools.