Nanopore sequencing/de

Nanopore-Sequenzierung

A DNA molecule passing through a nanopore can produce a signal that is interpreted as sequence information. Source: Wikimedia Commons, CC BY 4.0.

Nanopore-Sequenzierung ist ein Verfahren zur Sequenzierung einzelner Moleküle, bei dem DNA- oder RNA-Moleküle durch Nanoporen geleitet werden und dadurch Signalmuster entstehen, die computergestützt in Sequenzinformationen umgewandelt werden. In praktischen Systemen steuert ein Motorprotein die Bewegung der Moleküle; viele Nanoporen arbeiten dabei parallel. Zudem wandeln neuronale Netzwerke die erfassten Signale in lesbare Sequenzdaten um.

Der wissenschaftliche Wert der Nanoporen-Sequenzierung beruht auf vier miteinander verbundenen Eigenschaften: langen Sequenzierergebnissen, Echtzeit-Datenerfassung, direkter elektrischer Messung sowie tragbaren Geräten. Diese Eigenschaften machen die Nanoporen-Sequenzierung für die Genomassemblage, die Analyse struktureller Varianten, die Überwachung von Mikroben, die Reaktion auf Ausbrüche, die Umweltsequenzierung, die Transkriptomik sowie die direkte Erkennung bestimmter Nukleotidmodifikationen besonders nützlich.

Prinzip

Eine Nanoporen-Sequenzierungsmessung umfasst drei miteinander verbundene Schichten:

• Molekularer Schicht: Ein DNA- oder RNA-Strang wird mit Adaptern versehen und durch ein Poren von einem Enzym oder einem Motorprotein geleitet.
• Physische Schicht – Die Grundlagen oder kurzen „k-Mer“-Strukturen innerhalb der Messregion modulieren den Ionenstrom oder ein anderes messbares Signal.
• Rechenbereich (Computational Layer) – Die Signalverarbeitung (signal processing) und die Basiskalibrierung (basecalling) wandeln Zeitreihendaten in Auswertungsergebnisse (reads), Qualitätsbewertungen (quality scores) sowie Dateien für weitere Analysen um.

Ein einzelner aktueller Zustand („Current Level“) wird in der Regel nicht einer isolierten Basenstruktur zugeordnet. Das gemessene Signal hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter dem lokalen Sequenzkontext, der Chemie der Poren, der Drehgeschwindigkeit des Motors, der Temperatur, dem verwendeten Puffer, der Elektronik sowie der Version des Modells. Aus diesem Grund basieren die Verfahren zur Basenbestimmung („Basecalling“) und zur Erkennung modifizierter Basen auf Modellen – und nicht auf einfachen Abfragetabellen.

Vorgang vom Beispiel zum Ergebnis

Phase	Hauptfrage	Typischer Ausgabe	Qualitätsprüfungen
Proben- und Bibliotheksvorbereitung – Ist die Nukleinsäure lang, rein und kompatibel mit dem verwendeten Kit? – Bibliothek, die für die Sequenzierung geeignet ist. – Eingabedaten: Masse der Probe, Länge der Fragmente, Inhibitoren, Effizienz der Adapter-Ligierung.
Abfolge der Durchführungen	Reichen die aktiven Poren aus, um stabile Ergebnisse zu liefern?	Rohsignale und Durchführungsmetriken	Porenaktivität, Verteilung der Leseergebnisse, Ausbeute, Qualität im Laufe der Zeit
Basecalling	Welche Sequenz erklärt das Rohsignal am besten?	FASTQ- oder BAM-Dateien	Lesegenauigkeit, Qualitätsbewertungen, Kompatibilität mit Modellen und Chemieverfahren
Ausrichtung oder Klassifizierung	Woher stammen die Lesungen?	Gemappte Lesungen, Taxa oder Contigs	Kartierungsqualität, Abdeckung, Kontamination, Referenzverzerrung
Interpretation	Welche biologischen oder technischen Schlussfolgerungen werden unterstützt?	Varianten, Assemblagen, Methylierungsanalysen, Berichte	Kontrollen, Reproduzierbarkeit, Schwellenwerte, orthogonale Validierung bei Bedarf

Stärken

• Lange Texte können wiederholte Elemente, strukturelle Varianten, Haplotypen, Plasmide sowie komplexe genomische Regionen umfassen.
• Echtzeit-Sequenzierung ermöglicht die Analyse während des Laufs eines Prozesses und unterstützt somit eine schnelle Entscheidungsfindung.
• Die Methode der direkten Sensierung (Direct Sensing) kann Informationen über bestimmte Modifikationen von DNA oder RNA erhalten und bewahren.
• Portable Instrumente ermöglichen die Arbeit im Feld, im Unterricht sowie in Arbeitsabläufen mit geringer Infrastruktur.
• Flexibler Durchsatz ermöglicht sowohl kleine, gezielte Durchführungen als auch umfangreichere Projekte im Genomskalenbereich.

Einschränkungen und Fehlerquellen

Die Nanopore-Sequenzierung sollte nicht automatisch als überlegen gegenüber der Sequenzierung mit kurzen Leseabschnitten angesehen werden. Ihre Eignung hängt von der Fragestellung, der Probe, der erforderlichen Genauigkeit, den Kosten sowie dem Analyseverfahren ab. Wichtige Einschränkungen dieser Methode sind unter anderem:

• Rohlesefehler sowie systematische, kontextabhängige Fehler.
• Eine Empfindlichkeit von Sample-Qualität – insbesondere für Anwendungen, bei denen lange Lesezeiten erforderlich sind.
• Chemie, Porenstruktur und Abhängigkeit von der Modellversion.
• Homopolymere und die Interpretation modifizierter Basen in bestimmten Kontexten stellen Herausforderungen dar.
• Rechenanforderungen für Basiskallierung, Ausrichtung, Zusammenstellung (Assembly) sowie Variantenanalyse (Variant Calling).
• In klinischen, regulatorischen oder hochbedeutenden Umgebungen sind sorgfältige Kontrollmechanismen erforderlich.

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• MinION
• Bioinformatik
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Daten und Dateitypen

Rohes und verarbeitetes Nanoporen-Datenmaterial kann POD5- oder FAST5-Signaldateien, FASTQ-Daten, BAM- oder CRAM-Alignments, Sequenzierungszusammenfassungsdateien, Modifikationsmarkierungen von Basen sowie Ausführungsberichte enthalten. Gute Analysepraktiken dokumentieren das verwendete Instrument, die Flow-Zelle, die verwendete Chemie, das verwendete Kit, den Basenaufruf-Algorithmus (BaseCaller), die Version des verwendeten Modells, die Referenzdatenbank sowie die Parameter der Befehlszeile.

Gute Praxis

• Vor der Optimierung der Ausbeute muss das Protokoll an die biologische Fragestellung angepasst werden.
• Verwenden Sie Steuerelemente, um die Effekte der Bibliothek, der Poren, der Probe sowie der Analyse voneinander zu trennen.
• Berichten Sie über die Chemie, die verwendete Basistoffanalysemethode (Basecaller), die Modellversion sowie die Analyseparameter.
• Überprüfen Sie sowohl repräsentative Auszüge aus dem Text als auch aggregierte Statistiken.
• Stellen Sie hochwichtige Schlussfolgerungen möglichst mit unabhängigen Beweisen unter Beweis.

Selected papers and resources

• Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 2016.
• Jain M et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 2018.
• Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 2019.
• Wang Y et al. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology. 2021.
• Kovaka S et al. Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED. Nature Biotechnology. 2021.
• Oxford Nanopore Technologies. Dorado basecaller and related tools.

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