Nanopore sequencing/fr

Séquençage par nanopores

A DNA molecule passing through a nanopore can produce a signal that is interpreted as sequence information. Source: Wikimedia Commons, CC BY 4.0.

La séquençage par nanopores est une méthode de séquençage à l'échelle de la molécule unique, dans laquelle des molécules d'ADN ou d'ARN passent à travers des nanopores, provoquant des changements de signal qui sont ensuite convertis en informations de séquence par des algorithmes informatiques. Dans les systèmes pratiques, une protéine motrice contrôle le mouvement des molécules ; de nombreux nanopores fonctionnent en parallèle, et des logiciels basés sur des réseaux de neurones interprètent ces signaux bruts pour produire des séquences d'ADN ou d'ARN.

La valeur scientifique du séquençage par nanopores provient de quatre propriétés essentielles : des lectures de longueur importante des séquences, une acquisition en temps réel, une détection électrique directe des modifications des séquences, et un équipement portable. Ces caractéristiques en font un outil très utile pour l’assemblage des génomes, l’analyse des variantes structurelles, la surveillance des micro-organismes, la réponse aux épidémies, le séquençage de l’environnement, la transcriptomique, ainsi que la détection directe de certaines modifications des nucléotides.

Principe

Une mesure de séquençage par nanopore comporte trois couches liées entre elles :

• Couche moléculaire : Une chaîne d'ADN ou d'ARN est préparée avec des adaptateurs et guidée à travers une pore par une enzyme ou une protéine motrice.
• Couche physique : Les bases ou les contextes de k-mer courts, situés à l’intérieur de la zone de détection, modulent le courant ionique ou un autre signal mesurable.
• Couche computationnelle – Le traitement du signal et l’analyse des données convertissent les séries temporelles en résultats de lecture, en scores de qualité, ainsi que en fichiers destinés à des analyses ultérieures.

Un seul niveau actuel n’est généralement pas attribué à une base isolée. Le signal mesuré dépend du contexte de séquence local, de la chimie des pores, de la vitesse du moteur, de la température, du tampon utilisé, de l’électronique, ainsi que de la version du modèle. C’est pourquoi l’identification des bases (basecalling) et la détection des bases modifiées sont des tâches basées sur des modèles, et non des simples tableaux de référence.

Chemin de travail allant de l'échantillon au résultat

Étape	Question principale	Sortie typique	Contrôles de qualité
Préparation des échantillons et des bibliothèques	L’acide nucléique est-il suffisamment long, pur et compatible avec le kit ?	Bibliothèque prête à la séquençage	Masse d’entrée, longueur des fragments, inhibiteurs, efficacité de la liaison des adaptateurs
Ordre des exécutions	Les pores actifs sont-ils suffisants pour produire des lectures stables ?	Signal brut et métriques des exécutions	Activité des pores, distribution de la longueur des lectures, rendement, qualité au fil du temps
Basecalling	Quelle séquence explique le mieux le signal brut ?	Lectures FASTQ ou BAM	Précision des lectures, scores de qualité, compatibilité avec les modèles et les procédés chimiques
Alignement ou classification	D'où proviennent les données de lecture ?	Données de lecture mappées, taxons ou contigs	Qualité de la cartographie, couverture, contamination, biais de référence
Interprétation	Quelle conclusion biologique ou technique est soutenue ?	Variants, assemblages, analyses de méthylation, rapports	Contrôles, réplication, seuils, validation orthogonale si nécessaire

Atouts

• Les « longs textes » peuvent couvrir des répétitions, des variantes structurelles, des haplotypes, des plasmides, ainsi que des régions génomiques complexes.
• La séquençage en temps réel permet une analyse pendant l'exécution des procédures et facilite la prise de décisions rapides.
• La « détection directe » peut conserver des informations sur certaines modifications de l'ADN ou de l'ARN.
• Les instruments portables rendent possibles les travaux sur le terrain, l'enseignement ainsi que les activités dans des environnements à faible infrastructure.
• La « capacité de traitement flexible » (flexible throughput) permet de mener des analyses de petite envergure ciblées, ainsi que des projets à l’échelle du génome.

Limitations et sources d'erreurs

Le séquençage par nanopores ne devrait pas être considéré comme automatiquement supérieur au séquençage à lecture courte. Sa pertinence dépend de la question étudiée, de l'échantillon utilisé, de la précision requise, des coûts et du pipeline d'analyse. Parmi les limites importantes, on peut citer :

• Erreurs de lecture brutes et erreurs systématiques dépendantes du contexte.
• Une sensibilité de qualité, particulièrement adaptée aux applications nécessitant de longs temps de lecture.
• Dépendance de la chimie, des pores et de la version du modèle.
• Défis liés à l'interprétation des homopolymères et des bases modifiées dans certains contextes.
• Exigences en matière de ressources informatiques pour le séquençage, l'alignement des séquences, l'assemblage des acides aminés et l'identification des variants génétiques.
• Besoin de contrôles rigoureux dans des environnements cliniques, réglementaires ou à fort enjeu.

Applications

• Assemblage du génome – Les séquences longues aident à résoudre les problèmes de répétitions et de complexité structurelle.
• Variation structurelle – Les textes longs peuvent comporter des insertions, des suppressions, des inversions, des translocations, ainsi que des répétitions et des expansions.
• Génomique microbienne – identification rapide, analyse de la résistance aux antimicrobiens, reconstruction de plasmides et suivi des épidémies.
• Métagénomique et ADN environnemental – classification en temps réel de échantillons mixtes, avec un contrôle rigoureux de la contamination.
• Transcriptomique et ARN direct – Informations au niveau des isoformes ainsi que signaux de modification de l'ARN dans des workflows sélectionnés.
• Épigénétique et modifications de l'ADN – détection de la méthylation et d'autres modifications lorsque des modèles et des groupes de contrôle sont appropriés.
• Échantillonnage adaptatif – Enrichissement ou appauvrissement en temps réel des cibles en fonction de la décision de poursuivre ou non le séquençage d'une molécule.

Données et types de fichiers

Les données brutes et traitées provenant des nanopores peuvent comprendre des fichiers de signalisation POD5 ou FAST5, des lectures FASTQ, des alignements BAM ou CRAM, des fichiers de résumé de séquençage, des étiquettes de bases modifiées, ainsi que des rapports d'exécution. Une bonne pratique d'analyse indique l'instrument utilisé, la cellule de flux, les réactifs chimiques, le kit utilisé, le logiciel de détection des bases, la version du modèle, la base de données de référence, et les paramètres de la ligne de commande.

Bonnes pratiques

• Correspondre au protocole à la question biologique avant d'optimiser le rendement.
• Utilisez des contrôles pour séparer les effets liés à la bibliothèque, aux pores, aux échantillons et aux analyses.
• Indiquez les données de chimie, le nom de l'application utilisée pour l'appel de base (basecaller), la version du modèle, ainsi que les paramètres d'analyse.
• Examinez à la fois les lectures représentatives des données et les statistiques globales.
• Vérifiez les conclusions à fort impact en utilisant des preuves indépendantes lorsque c'est possible.

Articles et ressources sélectionnés

• Deamer D, Akeson M, Branton D. « Trois décennies de séquençage par nanopores ». *Nature Biotechnology*, 2016.
• Jain M et al. « Séquençage du génome humain à l’aide de nanopores et assemblage du génome humain à partir de lectures ultra-longues ». *Nature Biotechnology*, 2018.
• Wick RR, Judd LM, Holt KE. « Performance of basiccalling tools based on neural networks for sequencing using Oxford Nanopore ». *Genome Biology*, 2019.
• Wang Y et al. « Technologie de séquençage par nanopores, bioinformatique et applications ». *Nature Biotechnology*, 2021.
• Kovaka S et al. « Séquençage de nanopores ciblés par cartographie en temps réel du signal électrique brut, utilisant la méthode UNCALLED ». *Nature Biotechnology*, 2021.
• Oxford Nanopore Technologies. L'outil basecaller Dorado et les outils connexes.

Pages liées

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